校正（二代测序）：76 bp, 100 bp or 125 bp strand-specific paired-end sequencing on Illumina HiSeq 2500 or Illumina HiSeq 2000, respectively. 524,974,802 paired-end (2x250 bp) Illumina reads(seven-fold coverage of the genome). The reads were mapped to the PacBio genome assembly by Bowtie2.
Mapping: Saphyr System (Bionano) Bionano Solve 2.1 software
数据：https://genome.axolotl-omics.org NCBI BioProject database with accession numbers PRJNA378970 (genome data)
结 果
1.基因组测序组装
选取D/D品系（易于活体成像）进行基因组测序，基因组的组装参照fig1.b，采用PacBio三代长读长测序（读长达到57Kb(fig1c), 蝾螈最长的重复序列是34Kb），使用MARVEL进行组装，采用二代测序数据进行基因组矫正，contig组装采用Bionano（N50 contig 长度216kb，fig1.d），最终得到的N50 scaffold 长度3Mb。
组装的完整性评估，首先分析了non-exonic ultraconserved elements (UCEs)，98.5%的在脊椎动物和蝾螈中保守。另外为了评价完整性，研究还对22个组织的转录组进行了测序，85%的转录本能够比对到基因组上。同时通过全面的转录组数据集，对蝾螈基因组基因进行注释得到23251个编码基因。
2.蝾螈基因组存在大量的长末端重复反转录转座子
Contig中有65.6%，18.6Gb的重复序列，其中主要为LTR retroelement classes 和endogenous retroviruses（Fig2.a,b），并且包含超过10Kb的元件（Fig2.c）。重复序列的替换数目用来估计LTR retroelement的相对进化年限，通过分析发现蝾螈基因组经历了长周期的转座子活性，随后是最近的并且明显持续的扩张爆发（Fig2.d）
另外，蝾螈基因组的内含子长度要远大于人，小鼠和青蛙的；并且在内含子的扩增上，发育相关基因中的内含子扩增是受限的，而在人等其他物种中，发育与非发育相关基因中内含子的大小并无明显不同（Fig3.a）。Fig3.b具体展现了典型基因AGR2的事例。
3.HoxA基因簇分析
为了研究基因簇的组成，这里对HoxA位点进行了研究，HoxA在近端到远端的肢体发育过程中发挥重要的作用，并且在肢体再生中被重新激活。如Fig3.c所示，蝾螈的HoxA是人等同源基因的3.5倍长，而且存在多的重复，这很大程度上归因于HoxA3与HoxA4之间存在170Kb长的扩增。
4.蝾螈基因组缺少PAX3
经典的发育信号分子家族的分析，在蝾螈中，hedgehog和Wnt是存在的（Extended Data Figure 2.a,b）。但是PAX蛋白中，蝾螈基因组缺少PAX4含有PAX10，缺少PAX3含有PAX7 （Extended Data Figure 2.c）。
在蝾螈基因组中Sgpp2和Epha4（这两个基因在小鼠中存在于Pax3的两侧）存在，但是并没有Pax3，而且pax3相关的非内含子元件（CNEs）也不存在（Fig3.d）。
5.Pax7具有与Pax3类似的功能
在其他脊椎动物中，Pax7和Pax3在肌肉、神经管和神经嵴来源的组织发育中发挥重要的作用，在蝾螈中Pax3缺失，Pax7是不是具有类似的功能。文章采用TALEN和CRISPR技术（Fig4.a）对Pax7进行突变来进行研究。
Pax7突变缺失后，早期（17，20天）肌肉量上并没有体现不同，之后会影响蝾螈的直立姿态和延迟生长。6月大的蝾螈身体延伸出现问题（Fig4.b），体壁肌肉明显减少（Fig4.c）；3月大的蝾螈肢体（前肢）肌肉减少（Fig4.d）；前额骨发育缺陷（Fig4.e，小鼠Pax7缺失影响面部骨骼发育，面部骨骼是神经嵴的衍生物）；黄色素细胞（Fig4.f）和眼睛虹彩细胞（金色素）减少（Fig4.g，斑马鱼Pax7突变黄色素细胞和虹彩细胞消失）；神经管闭合出现问题（Fig4.h）。此外，像躯干肌肉（Extended Data Figure 4）和尾部肌肉（Extended Data Figure 4）同样受到影响，而非肌肉组织，如TU-J1和MBP的表达不受影响（Extended Data Figure 7.b,c）。
我只是分割线
测序组装32G的超大基因组不是一件容易事，感兴趣的科研汪可以研究下MARVEL, 对于研究再生的也可以偷偷关注下。没有生信基础又想搞研究那怎么办，请看下面
地址: 山东省泰安市高新区南天门大街
中国泰山高端人才创业基地511室
返回搜狐，查看更多